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什么是微分干涉差显微镜?DIC是什么原理?

发布时间:2019/12/19

什么是微分干涉差显微镜?DIC是什么原理?

1952年,Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。

微分干涉相衬显微镜(DIC显微镜 differential interference contrast microscope)的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光,透射式DIC显微镜有四个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Nomarski棱镜,即DIC棱镜,此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Nomarski棱镜,即DIC滑行器,它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态,可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕,如下图。
DIC显微镜下的硅藻(伪彩色)
DIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。
落射式的DIC显微镜则只需要三个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜和检偏器(analyzer),其光学原理如图所示:

由图可知:由光源发出的光波经起偏器后经半透半反镜入射至Nomarski偏振棱镜,棱镜将其分成两束具有微小夹角、振动方向相互垂直且振幅相等的线偏振光,通过筒长无限显微物镜后,产生剪切量为△x(略小于显微镜分辨率)的平行光入射到放置在载物台上的被测表面,从被测表面反射的两束正交偏振光各自经原路返回,由棱镜重新复合共线,经检偏器后成像在像面上。由于被剪切的光束产生的分离量略小于显微镜的分辩极限,因而在视场中看不到干涉条纹,通过将被测样品的位相变化转化为光强的变化,可看到具有立体感的浮雕成像。
DIC显微镜广泛应用于生物医学、材料科学等领域。
微分干涉相衬观察法 (DIC) 显微镜检查是明场显微镜检查的明智之选,利用这种先进的技术手段可以观察到未染色的试样,而这些试样在明场中成像较弱。
利用偏振光观察浮雕样成像
未染色试样通常并不显眼,在明场显微镜检查中几乎看不到试样的细节。但实际上,这些试样会与穿过它们的光源发生作用,并产生相移,而这些现象肉眼是看不见的。染色会导致振幅偏移,且穿过的光线强度会存在差异,但绝大多数情况下,无生命的试样才会发生上述现象。DIC 显微镜检查是一种利用光程长度的梯度差和相移,令相位物体在光学显微镜下清晰可见的技术手段。用户可以利用这种方式,通过适当的相衬度和分辨率来观察活细胞和有机体。
DIC 显微镜产生的图像为浮雕状,看起来有投影。这些图像没有光晕现象,相对其他显微镜而言,由于具备光学切片功能,即使较厚的试样也依然能够成像。
在 DIC 显微镜检查中,只有偏振光可用于试样照明。上述偏振光通过偏光正交平面,被色散成两条不同的光射线。这两条光射线彼此非常接近。由于这两条光射线在试样中会发生折射或散射,因此,会产生不同的相移。如果这些光射线重新聚合,它们会互相干涉。光线此时为椭圆偏光。该偏光将通过检偏镜转变成振幅移位。通过这种方式,令高达 1/200 波长(使用照相机时,甚至达 1/1000 波长)之间波长差的相位移动,以及整个波长都清晰可见。


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