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显微镜的光学性能

2019/12/19

显微镜的光学性能

显微镜的光学性能由下列八个基本光学参数(或参量)来决定:

(一)数值孔径
数值孔径又叫镜口率。它是指所观察的物体与镜头间介质的折射率n与物镜镜口角α一半的正弦值的乘积。用N.AA.来表示。即: N.A.nsin(α/2
所谓镜口角是指被观察点射入物镜前透镜的边缘光线之间的夹角。


数值孔径是物镜与聚光镜的重要参数,与显微镜的其它各个光学参数都有密切关系。一般希望它越大越好。从公式中可知:提高数值孔径有两种方法,一是增大镜口角,二是增大物镜与标本之间的折射率。
采取前一种方法时,可以让标本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近,α总是小于180°。这样,sin(α/2)也小于1。而空气的折射率n1。因此,干燥系物镜的数值孔径nsin(α/2)总是小于1,一般在0.040.95之间。
采取后一种方法时,可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。如香柏油的折射率n1.515,使用香柏油为介质时,可使数值孔径达到1.2以上。这就是为什么在有些情况下要使用油镜的原因。目前油镜所能达到的最大数值孔径为1.4

(二)分辨率
分辨率又叫鉴别率或分辨本领。所谓分辨率是指显微镜分辨被检物体细微结构的能力。它与分辨距离成反比。分辨距离是指能被分辨开的两物点间的最小距离。分辨距离越小,显微镜的分辨率越高。如果两物点间的距离小于分辨距离,就会把两点误看成一点,无法看清其结构。显微镜的分辨率是由物镜决定的。目镜只起放大作用,不能增加显微镜的分辨率。
在普通中心照明的情况下,物镜的分辨距离d由下式决定。
d=(λ/2N.A.
式中:d表示分辨距离, 单位是微米,λ表示照明光线的波长,单位也是微米。
在可见光中,亮度最大而且对人眼最敏感的波长为0.55μm,物镜最大的N. A.1.4。代入上式可得d近似为0.2μm。即,使用普通光学显微镜,在中心照明的情况下,分辨距离的极限为0.2μm。也就是说,小于0.2μm的两物体,普通光学显微镜无法区分。
使用紫外线,可以减小照明光线的波长,能使分辨距离达到0.1μm。但因紫外线不能为人眼所见。只能拍成照片后再观察。
电子流的波长只有0.00387nm。利用“电子透镜”或磁透镜来控制电子流,所制成的电子显微镜的分辨距离达零点几nm。可以用它去观察原子的结构。

(三)放大率
显微镜的放大率等于物镜的放大率和目镜的放大率的乘积。从原理上讲,放大率可以做的非常大。但是,如果标本的细节不能被物镜分辨开来,放大的再大,也毫无意义。理论上可以推导出来,显微镜最合适的放大率(称为有效放大率,用M有效表示)是在物镜的数值孔径的5001000倍之间。即500N.A.≤M有效≤1000N.A.
在有效放大率范围内,眼睛可以长时间观察而不易疲劳。如果放大率低于500 N.A.,观察起来就很吃力。如果高于1000N.A.,则会使像质变坏,甚至造成不真实的像。因此,超过1000N.A.的放大率称为无效放大率。

(四)工作距离
工作距离是指显微镜调焦后,在使用标准盖玻片和标准机械筒长的情况下,物镜的下表面至盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大率越高,工作距离越短。一般10倍以下的低倍物镜,工作距离为57mm,而100倍的油镜,其工作距离只有0.19mm左右。

(五)焦点深度
当显微镜调焦于标本中某一平面后,不仅这一物平面可以看清楚,而且和它相连的上下两个物平面也能同时看清楚。这上下两个物平面之间的距离叫做焦点深度,简称焦深。
显微镜的焦深是很小的,而且数值孔径越大、总放大率越大,焦深越小。例如,使用N.A.1.25/100倍的油镜、12.5倍的目镜观察时,焦深只有0.27μm。这就是说,调焦后一次只看清楚0.27μm厚的一个薄层。而普通标本一般都有几个微米厚。要想看完整个标本,需要使用显微镜的微调机构,自上而下分层观察。

(六)清晰度
显微镜成像的清晰度取决于其光学系统,尤其是物镜的光学性能。它与显微镜的设计、制造、使用和保管都有关系。是一个很重要而又很复杂的问题。从使用和保管的角度来说,影响清晰度的主要原因有:所使用的盖玻片的厚度不合格、调焦没有调到理想位置、总放大率用得过大、油镜的镜头没有擦干净、镜片生霉等。

(七)镜像亮度
镜像亮度是指显微镜中所看到的物像的亮暗程度。为了便于观察,我们希望所成的像亮一些。在外部光线不变的情况下,镜像亮度与数值孔径的平方成正比,而与总放大率的平方成反比。要想使镜像亮度大些,应使用大数值孔径的物镜,配以低放大率的目镜。例如,在物镜相同的情况下,使用5倍的目镜与使用10倍的目镜相比,其镜像亮度要大4倍。
使用电光源的显微镜,其镜像亮度可以通过调节照明灯的亮度来控制。

(八)视场

视场又叫视野。是指显微镜一次能够看到的被检物体的范围。通常我们希望视场尽可能大些。显微镜的视场由物镜的视场和目镜的视场共同决定的。普通物镜的视场小于20mm,大的可达40mm以上。普通10倍目镜的视场为14mm,大的可达24mm以上。物镜与目镜一旦设计好后,其视场便固定了。因一般显微镜的视场较小,不可能在一个视场内看到整个标本,只能看到标本上极小的一个小圆块。而且视场的大小与显微镜的总放大率成反比。总放大率越大,视场越小。解决的办法是利用移动器,使标本的各部分依次进入视场,轮流观察。
上述八个参数之间是互相联系、互相制约的。例如,使用数值孔径大的物镜,其分辨率、放大率、镜像亮度都大,对观察有利。但它的工作距离短、焦点深度和视场小,使用起来不太方便。在使用中应根据具体使用情况,照顾重点,兼顾其他。使用显微镜的根本目的是要看清楚样本的细节,否则,就失去了使用显微镜的意义。从这个前提条件看来,分辨率应摆在首位,放大率摆在第二位。其余各参数应列入从属地位。因为前两个参数是决定被检物体能否看得见的问题。其余各参数只是决定使用方便不方便或观察效果好不好的问题。因此,使用时,应在保证主要参数满足要求的前提下,适当兼顾其余各参数。


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