显微镜观察检测细胞

相差显微镜

活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。20世纪30年代 荷兰 Zernike
原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。

相差显微镜观察活细胞的步骤如下（1）调整好相差显微镜（2）观察瓶皿准备（3）调光；（4）调节与摄影（5）观查细胞

细胞的生长状态生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。

若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。

各种细胞及各代细胞增殖的时间不尽相同。
原代细胞、成体组织的潜伏期较长，24h后仅见到部分细胞开始贴壁，9～12d长满瓶底，细胞融合呈交叉重叠生长。
传代细胞系、胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期、对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。

一旦发现细胞长满瓶底80％就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。
悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。

注意事项
标准化生产的培养板、培养瓶或皿一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。
准备观察的瓶、皿要平坦，质地均匀，透光度好，在观察前将培养瓶、皿面擦净。
天气较冷时，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。
对原代细胞培养进行相差显微照相，应在换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度。
观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈震荡；观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。

活细胞的观察检测方法

1、暗视野显微镜技术观察活细胞

原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。

优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。

应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。

2.缩时显微摄影术观察

优点：可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。
缺点：较昂贵

3.体外活细胞染色观察

体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。

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