荧光显微镜的原理

荧光显微镜是用人眼不可见的一定波长的紫外线作光源照射被检物体，使之受激发后而产生人眼可见的荧光,然后再经显微镜成像系统放大来进行镜检。荧光显微术是生物,医学中的重要研究手段，如对生物组织、生理、病理、微生物、医药、食品、化学等诸方面的鉴定等。

一、荧光

普通光是由发光体质点的热运动所引起的辐射；而荧光是非温度辐射，是一种冷光。荧光有多种，如光化荧光（由光源激发而产生的荧光），放射出荧光（由放射性物质激发而产生的荧光）。生物荧光（如磷的氧化时发出的荧光），等等。而荧光显微镜则是利用光化荧光这原理设计制造，达到荧光显微术镜检的目的。

由于荧光显微镜的光源是利用人眼不可见的短波光，因而就大大提高了物镜的分辨率，图像与背景的反差亦甚为明显。

二、荧光现象

将荧光物体放到光谱中的各色区域，就可发现引起荧光最有效的光线是光谱上波长较短的区域，即近紫外线区域，波长约为320-400nm。这种现象的实质是分子吸收了短光的能量（波长越短，光能越强），又以发光的形式以波长较长和荧光射出，而为人眼可见，这就是荧光现象。荧光接近可见光的红光端，大部分的荧光现象是符合这一规律的。

荧光现象可分为两种：

1. 第一次荧光现象；又称固有荧光或自发荧光，当经紫外线的照射后，就能发出荧光的物质；

2. 第二次荧光现象：又称激发荧光，当经紫外线照射后不能或只部分发生微弱的荧光，这样就需先用荧光素处理，再经紫外线照射才能发生荧光，这是因组织内吸附或溶解有荧光素的缘故。

三、荧光显微镜的原理

滤色块是荧光显微镜的重要部位，其核心部件由激发光滤色片（first barrier filter）、发射光滤色片（second barrier filter）和半透半反滤色片(beam-splitting mirror)组成。

1．激发光滤色片及发射光滤色片：根据光源和荧光色素的特点，通常选用以下三类配套，提供一定波长范围的激发光，并使样品激发出的荧光透过，到达目镜成像。

紫外光激发：激发光滤色片可使紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。与之相应的发射光滤色片可允许蓝光通过，视野内的光呈蓝色，如应用于DAPI染色。

蓝光激发：激发光滤色片可使蓝光通过，阻挡其他波段的光。与之相应的发射光滤色片可允许绿光通过，如GFP 染色标记。

绿光激发：激发光滤色片使绿光通过，阻挡其他波段的光。与之相应的发射光滤色片通常可允许红光通过，如Rhodamine染色。

2．半透半反滤色片：它的作用是完全阻挡激发光通过，而将其反射；并透过相应波长范围的发射光。其型号与激发光滤色片和发射光滤色片相对应。

3. 光路：光线在荧光滤色块中的传播光路为：反射光滤光片只允许光源中特定波长的光线透过，这部分激发光到达半透半返滤色片时被反射后通过物镜照射到样品上，样品中的荧光基团被激发光激发，发射出长波长的荧光；发射光通过物镜，透过半透半反滤色片，到达发射光滤色片，此时又只有特定波长的光线透过，最后通过目镜被我们肉眼看到的就是样品中的荧光了。